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曾昭凡1唐新華2 谷涌泉3
(1海南省人民醫院血管外科 海口 570311; 2南昌大學二附院血管外科 南昌 330006;
3 首都醫科大學附屬北京宣武醫院血管外科 北京 100053)
摘要 目的 探討自體骨髓干細胞移植應用于下肢慢性缺血性疾病的臨床療效評價其療效。方法 分析2008年1月至2009年4月本科應用自體骨髓干細胞移植法治療的下肢慢性缺血性疾病患者40例。將患者隨機等分為2組。第1組采用自體骨髓干細胞下肢肌內注射法移植,第2組采用下肢動脈腔內注射法移植。患者在抽取骨髓前均使用粒細胞集落刺激因子(GCSF)動員骨髓細胞2~3d,300µg /d,動員末日抽取骨髓血200ml,經分離純化后移植入患肢(雙下肢患者選取癥狀重側)。每月定期電話隨訪癥狀的變化。6個月后復查皮溫、經皮氧分壓(TcPO2)、踝肱指數(ABI)、數字減影血管造影(DSA),隨訪內容包括疼痛、冷感、麻木、跛行距離,觀察潰瘍壞疽情況。結果 全部患者獲得隨訪,移值后6個月各項觀察指標與移植前對比,治療側患肢皮溫、TcPO2變化差異有統計學意義;ABI變化差異無統計學意義;側支循環再生及臨床癥狀各指標總有效率均≥60%。無嚴重并發癥發生。結論 經動員刺激后的自體骨髓干細胞移植治療下肢慢性缺血性疾病是一種簡單、安全、有效的方法。
關鍵詞:自體骨髓;干細胞移植;下肢缺血
Observation on the clinical efficiency of autologous bone marrow stem cell transplantation on chronically ischemic disease of lower limb
[Abstract] Objective To probe into the application of autologous bone marrow stem celI transplantation in the treatment of ischemic disease of Iower extremity and evaluate the curative efect.Methods 40 patients with chronically ischemic limbs had been treated from January 2008 to April 2009. The bone marrow 0f each patient was stimulated by an injection of the recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulatory factor(GCSF), 300µg /d, for 2~3 days. The bone marrow 200ml was drawn from the iliac spine and the stem cells were obtained, after disassociated and depuated, transplanting into the more severely ischemic limb. They were foIlowed by phone once a month after the transplantation for six months. The skin temperature, transcutaneous oxygen pressure(TcPO2), digital subtraction angiography(DSA)and ankle/brachiaIindex(ABI)were rechecked at 6 months later, and the symptoms of pain, cold, numbness, intermittent claudication and physical signs of ulcer and gangrene were evaluated. Results All of 40 patients were invoIved in the analysis of result: ①The skin temperature, TcPO2 have Statistical significance.②ABI has no statistical significance.③DSA and all of the clinical symptoms had been valued more than 60%.④No severe complication to be happened. Conclusion transplantation of autologous bone marrow stem cell is efective in the treatment of ischemic disease of lower limb, which is a simple, safe and efective treatment for ischemic disease of lower limb.
[Key words] Autologous bone marrow; Stem cell implantation ; Lower limb ischemia
下肢動脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎及糖尿病性下肢慢性缺血性疾病是臨床上的難治之癥,盡管血管搭橋和腔內介入等方法已有了很大的進展,但對于晚期流出道條件不好的患者,仍無滿意的治療方法。近年來,筆者采用經動員刺激后的自體骨髓干細胞移植治療此類疾病,取得滿意療效,現報告如下。
1 臨床資料
1.1 病例選擇及其一般資料
入組標準:經彩色多譜勒及下肢動脈數字減影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)檢查確診為下肢慢性缺血性疾病,且經半個月以上傳統的擴血管、抗栓等非手術治療無明顯效果者。急性下肢缺血及多發性大動脈炎所致的慢性下肢缺血者不予入組,雙下肢患者選取癥狀重側觀察。符合條件患者40例,男32例,女8例,男女比例4∶1。年齡31~87(平均69.2)歲。病因包括:單純下肢動脈硬化閉塞癥21例,糖尿病合并下肢動脈硬化15例,血栓閉塞性脈管炎4例。臨床癥狀Fontaine分級:Ⅱ級6例,Ⅲ級11例,Ⅳ級23例。合并糖尿病15例,冠心病19例,高脂血癥23例,腦梗死12例。分組:將40例患者隨機等分為2組。第1組采用自體骨髓干細胞下肢肌內注射法移植,第2組采用下肢動脈腔內注射法移植。
1.2 治療方法
移植前患者均使用人用重組粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony–stimulating factor GCSF,潔欣,150µg/支,江蘇吳中中凱生物制藥有限公司)2~3d,每天300 µg,分1~2次皮下注射,動員的第1天即開始使用低分子肝素以預防血栓形成。當外周血白細胞增加至(25~40)×109/L(平均31×109/L)時,即送手術室在局麻下使用帶側孔的骨髓穿刺針從髂后上棘抽取骨髓血200mL;去除紅細胞,密度梯度法離心,分離出單個核細胞,再將收獲的單個核細胞制成50mL的細胞懸濁液備用。計數細胞總量并測定CD34+細胞含量。本組單次移植提取的單個核細胞總量為(1.0~9.0)×109個,平均5.8×109個,其中CD34+細胞含量為(4.1~7.6)%,平均5.2%,CD133+細胞含量為(1.1~3.4)%,平均1.9%。第1組在手術室靜脈全麻或硬膜外麻醉下進行。將采集的單個核細胞配制成濃度約為2×l08/L的混懸液,足部按1cm×lcm,腿部按3cm×3cm間距肌內注射,每個部位約1mL。第2組在放射介入中心局麻下進行,常規Seldinger法穿刺股總動脈成功后,將制備好的細胞懸液動脈腔內緩慢注射。
1.3 觀察指標及評判標準
1.3.1 臨床癥狀按以下標準分值量化記錄[1] 疼痛:根據患肢疼痛的程度分為5級。0級為無疼痛;1級為偶有疼痛,被問及能回憶起;2級為疼痛經常出現但能耐受,不需或偶用一般止痛劑;3級為經常用一般止痛劑;4級為因疼痛影響睡眠,一般止痛藥難以緩解。冷感:根據患肢有無冷感及冷感的程度分為5級。0級為無冷感;1級為患者偶述受累肢體有發涼、怕冷的感覺;2級為受累肢體經常有發涼、怕冷的感覺;3級為受累肢體有明顯的冷、涼感覺,需要采用局部保溫措施,癥狀才能取得一定程度的緩解;4級為受累肢體有明顯的冷、涼感覺,采用局部保溫措施,癥狀也無明顯改善。麻木感:根據患肢有無麻木感及麻木的程度分為5級。0級為無麻木感;1級為偶爾有輕度麻木感;2級為經常有輕度麻木感;3級為經常有輕度麻木感,有時有嚴重的麻木;4級為經常有嚴重的麻木感。缺血性潰瘍:患肢移植前,0級為無潰瘍及潰瘍形成傾向;2級為有潰瘍形成傾向(包括:皮膚顏色改變、皮膚硬結、局部紅腫等);4級為有潰瘍形成。移植后,0級為完全愈合;1級為潰瘍面積縮小50%以上;2級為潰瘍面積縮小20%~50%;3級為潰瘍面積變化在±20%以內;4級為潰瘍面積增大20%以上。下肢間歇性跛行:根據患肢在正常速度(60~70 m/min)步行的距離分為5級。0級為行走≥500m,無疼痛;1級為行走400~499 m,有疼痛;2級為行走300~399m,有疼痛;3級為行走100~299m,有疼痛;4級為靜息痛,無法行走或行走<100m,有疼痛。
1.3.2 輔助檢查指標 患者在移植前均行患肢皮溫、踝肱指數(ankle/brachial index,ABI)、經皮氧分壓(transcutaneous oxygen pressure ,TcPO2)測定,記錄測定值。DSA檢查:患者在移植前均行雙下肢DSA檢查,對移植治療肢體側支循環的再生情況按以下方法進行量化記錄[2]:0級為無新生側支血管;1級為少許新生側支血管;2級為中量新生側支血管;3級為豐富新生側支血管。
1.3.3療效評判 應用上述的肢體疼痛、冷感、麻木感、缺血性潰瘍的大小及跛行距離進行療效評判。評判標準分為顯效、良好、改善、無效、惡化5個等級。顯效:移植后癥狀緩解3級或以上。良好:移植后癥狀緩解2級。改善:移植后癥狀緩解1級。無效:移植后癥狀無變化。惡化:移植后癥狀加重。
1.4 隨訪標準
患者均隨訪,時間為6個月,每個月定期電話隨訪癥狀的變化,6個月后復查DSA 、皮溫、TcPO2及ABI,記錄疼痛、冷感、麻木、跛行距離及潰瘍壞疽情況,并進行分級處理。
1.5統計學處理
計量資料以 ±
S表示,組間比較采用配對數據均數差異t檢驗,由第一作者輸入SPSS12.0統計軟件進行統計分析。
2 結果
2.1 療效
治療后6個月比較 40例患者資料均進入結果分析。兩組移植部位皮溫及TcPO2均有升高,移植前后差異有統計學意義(
P<0.01);兩組ABI變化均不明顯,移植前后差異無統計學意義(
P>0.05)(表1);兩組側支循環再生評分及臨床癥狀各指標評分示移植后總有效率均≥60%(表2)。
表1 移植前后患肢皮溫、ABI及TcPO2的變化 (
±S n=40)
指標
第1組 第2組
移植前 移植后6個月
t P 移植前 移植后6個月
t P
皮溫(℃) 27.6±1.2 29.1±1.8 5.83 <0.01 28.1±1.4 29.7±1.6 4.74 <0.01
ABI 0.49±0.09 0.49±0.11 0.46 >0.05 0.51±0.09 0.51±0.08 0.77 >0.05
TcPO2(kPa) 3.5±0.46 3.8±0.60 5.16 <0.01 3.4±0.45 3.8±0.37 5.66 <0.01
(注:1kPa=7.5mmHg)
表2 移植后患肢臨床癥狀及側支循環的變化 (例)
指標
第1組 第2組
移植后6個月 移植后6個月
肢數 顯 良 改 無 惡 總有 肢體 顯 良 改 無 惡 總有
體量 效 好 善 效 化 效率(%) 數量 效 好 善 效 化 效率(%)
疼痛 19 1 5 7 4 2 68.4 18 1 2 9 5 1 66.7
冷感 20 1 4 9 6 0 70.0 19 0 2 10 5 2 63.1
麻木 14 0 1 8 4 1 64.3 15 0 1 9 3 2 66.7
潰瘍 11 1 2 4 3 1 63.6 12 2 2 5 1 2 75.0
跛行 20 0 5 8 6 1 65.0 20 1 3 8 8 0 60.0
側支循環20 1 2 11 6 0 70.0 20 0 2 11 7 0 65.0
2.2 并發癥
兩組患者除移植后1~3d局部注射處脹痛外,均未出現心梗、腦梗及腫瘤等嚴重并發癥,亦無其他異常癥狀和體征出現,心電圖和肝腎功能無特殊改變。
3 討論
利用骨髓分離出造血干細胞、血管內皮祖細胞等細胞,并利用其橫向分化或定向分化為血管內皮細胞的功能,將它們移植于缺血的下肢,可促進血管再生
[3,4]。在我國應用這種治療性血管新生的方法已有6年多歷史,其療效各家報道不一[5,6]。本課題組采用主、客觀雙重指標進行療效評價,結果令人滿意:治療后客觀指標皮膚溫度及TcPO2有明顯改善(
P<0.01);主觀指標疼痛、冷感及麻木癥狀有明顯緩解,總有效率≥60%;跛行距離、潰瘍創面及側支血管再生亦有明顯變化。踝肱指數則無明顯變化(
P>0.05),考慮可能原因為干細胞僅是促進了小血管的再生,而對大血管血流變化的影響不明顯,再者本組病例大多病程較長,踝部大血管本身已有嚴重病變,多有重度狹窄或閉塞,干細胞不可能對它有太大的影響。踝肱指數反映的是踝部大血管的變化,因而在治療后它的變化也就不可能明顯。本組病例均無心、腦血管意外及惡性腫瘤等嚴重并發癥發生。
干細胞是具有高度自我復制功能,同時又具有高度分化和增殖能力的細胞,在適當的條件下可以分化為不同組織來源的細胞[7]。骨髓干細胞主要由造血干細胞、間充質干細胞和內皮祖細胞組成。它們可以在缺血局部橫向分化為血管內皮細胞,形成新的側支血管,從而改善患者局部血供,達到治療目的。內皮祖細胞是血管內皮細胞的祖細胞,在特定的環境下可以發展為血管內皮細胞,另有報道稱間充質干細胞亦可分化為血管內皮細胞[8,9]。通常用CD34+細胞數和集落培養評估分離純化的干細胞的數量及分化功能。CD34抗原是一種表達在早期造血干細胞、小血管內皮細胞和胚胎纖維母細胞表面的一種特異性表面抗原,它隨細胞的成熟逐漸減弱至消失[10]。因此CD34+細胞數可以作為評估分離純化的干細胞的指標。正常人穩定狀態下骨髓中CD34+細胞絕對數為(3.8±0.8)×106/L[11],由于CD34抗原在造血干細胞和內皮祖細胞組成上都有表達,并且還有部分造血干細胞定向分化內皮祖細胞[12],故可用CD34+細胞數量粗略估測內皮祖細胞的分離效果。本組病例單次移植提取的單個核細胞總量為(1.0~9.0)×109個,平均5.8×109,其中CD34+細胞含量為(4.1~7.6)%,平均5.2%。據谷涌泉教授研究報道干細胞移植治療的效果與單個核細胞總量有直接的相關性,每個注射點的細胞總量要大于1×105個,每側肢體細胞總量要大于1×108個[1]。
骨髓中存在許多種類的成體干細胞,除上述外還包括間充質細胞、成纖維細胞等多種細胞亞群。因此相對于外周血來源的單個核細胞而言,骨髓來源的單個核細胞群中含有更多的有利于血管新生的細胞亞群[13]。GCSF是傳統的強有力的骨髓干細胞動員劑,經動員刺激的骨髓內存在大量更新的、分化能力更強的干細胞,還可使附壁的骨髓間充質細胞的貼壁力下降,經過帶側孔的骨髓穿刺針的用力抽吸,可使更多的骨髓間充質細胞被抽出,同時也可得到一部分細胞生長因子[13,14]。本組患者經骨髓動員刺激后,其CD34+細胞絕對數大大增加。為了獲得更高純度的CD34+細胞,可采用免疫磁珠分選法從單個核細胞混懸液中分選,這種經分選后的細胞混懸液含有更高濃度的CD34+細胞,用它移植于慢性缺血性肢體效果可能會更好[15]。
通過對本組40例下肢慢性缺血性患者的療效觀察,進一步證實了經GCSF動員刺激后的自體骨髓干細胞無論是采取肌內注射或動脈血管腔內注射移植,都是安全有效的,且有抽取骨髓血少、細胞數量多等優點。
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